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嵌合抗原受體T細(xì)胞（Chimeric Antigen Receptor T Cell，CAR-T）治療產(chǎn)品因其在血液腫瘤中的顯著療效，已成為國(guó)際腫瘤免疫治療研究領(lǐng)域中的新熱點(diǎn)，也成為治愈腫瘤的新希望。
但是，在CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)中存在復(fù)制型病毒（Replication Competent Virus，RCV）污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求對(duì)于臨床使用的慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品和患者均要進(jìn)行復(fù)制型病毒的檢測(cè)。
PART 01
什么是復(fù)制型病毒？
在CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的制備過(guò)程中，通常利用慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將CAR基因高效地導(dǎo)入T細(xì)胞中，但在使用這些病毒載體的同時(shí)也帶來(lái)了CAR-T產(chǎn)品污染復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒（Replication Competent Retrovirus，RCR）或復(fù)制型慢病毒（Replication Competent Lentivirus，RCL）的潛在風(fēng)險(xiǎn)。RCL和RCR都可以稱為復(fù)制型病毒（RCV），RCV通過(guò)病毒載體回復(fù)突變產(chǎn)生，是具有復(fù)制能力的病毒。
PART 02
復(fù)制型病毒對(duì)患者有哪些安全性風(fēng)險(xiǎn)？
RCL/RCR對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)表現(xiàn)在兩個(gè)方面：
（1）它們同逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一樣可以整合在細(xì)胞基因組中，這種整合可能使得一種能夠激活原癌基因，破壞抑癌基因或使促細(xì)胞生長(zhǎng)的因子表達(dá)增高，從而增加二次腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)；
（2) 因其具有復(fù)制性，即可產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒，加之采用了可感染多種細(xì)胞的膜蛋白，大大增加了整合造成二次腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。
盡管在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體發(fā)展的過(guò)程中，研究者一直在采取多種措施（包括載體的設(shè)計(jì)、病毒載體包裝方法等）以降低RCR/RCL的風(fēng)險(xiǎn)，基本消除了RCL重組產(chǎn)生的可能性，但仍不能完全排除污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此RCL/RCR的污染風(fēng)險(xiǎn)始終是藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)一個(gè)重要的關(guān)注點(diǎn)。
PART 03
復(fù)制型病毒是如何產(chǎn)生的？
目前，制備CAR-T細(xì)胞所用的慢病毒載體和γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體均為復(fù)制缺陷型載體，這在理論上大幅降低了產(chǎn)生復(fù)制型病毒的風(fēng)險(xiǎn)。然而，在病毒載體的制備方法以及制備過(guò)程中，仍存在產(chǎn)生RCL或RCR的潛在風(fēng)險(xiǎn)。這些風(fēng)險(xiǎn)主要來(lái)自于在病毒載體生產(chǎn)過(guò)程中，穿梭質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒及包裝細(xì)胞中的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄元件之間，或病毒載體與T細(xì)胞的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄元件之間，發(fā)生的同源或非同源重組。
由此可見(jiàn)，RCV可能產(chǎn)生在病毒載體生產(chǎn)階段，也可能產(chǎn)生在CAR-T細(xì)胞制備階段。并且在患者接受治療后，隨著CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)擴(kuò)增，也依然存在產(chǎn)生RCV的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
圖1 細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)流程
PART 04
復(fù)制型病毒的監(jiān)管要求
針對(duì)RCV的風(fēng)險(xiǎn)，中國(guó)、美國(guó)及歐洲的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)均發(fā)布了明確的指導(dǎo)原則，要求在病毒載體的設(shè)計(jì)上應(yīng)盡可能降低與野生型病毒相關(guān)的任何致病性，并盡可能將病毒重組和回復(fù)突變的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。同時(shí)，在產(chǎn)品的生產(chǎn)和應(yīng)用的不同階段進(jìn)行RCL的控制，以保障患者的用藥安全。相關(guān)法規(guī)指南如下：
表1 復(fù)制型病毒相關(guān)的法規(guī)指南
PART 05
RCR/RCL檢測(cè)的方法
《CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測(cè)研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)》提到，目前RCR/RCL的檢測(cè)方法主要有指示細(xì)胞培養(yǎng)法、ELISA法(p24蛋白測(cè)定)、PCR/qPCR法（通過(guò)psi-gag或VSV-G聚合酶鏈反應(yīng)）和轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定法(PERT)等。其中，qPCR法因其具有檢測(cè)時(shí)間短、環(huán)境條件簡(jiǎn)單、靈敏度高和可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被許多CAR-T申報(bào)企業(yè)作為快速放行方法。
熙寧生物|精翰生物目前已獨(dú)立建立了多種qPCR檢測(cè)RCL/RCR的方法，檢測(cè)的目標(biāo)基因涵蓋慢病毒載體包膜VSV-G、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包膜GALV，以及貓內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒RD114等，最低靈敏度能夠達(dá)到2或5拷貝數(shù)/反應(yīng)。此外，我們還與合作伙伴共同建立了基于細(xì)胞培養(yǎng)法的RCL檢測(cè)方法。以上提及的多種方法均已進(jìn)行驗(yàn)證，可供申辦方直接使用。
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